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冈崎片段

王朝百科·作者佚名  2009-10-24
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DNA双链进行半保留复制时,在DNA的滞后链的不连续合成期间生成的片段。

冈崎片段产生的位置

基本信息中文名

冈崎片段

英文名

Okazaki fragment /Okazaki piece

发现者

冈崎令治(Reiji Okazaki)(日本)

发现时间

1966年

概念DNA复制过程中,两条新生链都只能从5'端向3'端延伸,前导链连续合成,滞后链分段合成。这些分段合成的新生DNA片段称冈崎片段。

长度冈崎片段相对比较短的DNA链。细菌冈崎片段长度1000-2000核苷酸,真核生物冈崎片段长度100-200核苷酸。

发现背景1968年,冈崎(Okazaki)及其同事进行了两组实验。

第一组实验是脉冲标记实验(pulse-labeling experiment)。实验以大肠杆菌(E.coli)为材料,在培养大肠杆菌的培养基中加入同位素[H]3标记的dTTP,经30秒后,DNA开始复制,分离DNA,然后在碱中沉淀,变性,让新合成的单链和模板链分开,再用CsCl密度梯度离心,以沉降的快慢来确定片段的大小,再检测放射性标记,结果表明被[H]3标记的片段,也就是新合成的片段,沉淀系数为20S左右,即都是长1000~2000Nt的DNA片段,而亲本链要比它大20~50倍;

第二组实验是脉冲追逐实验。实验目的是检测早期合成的DNA片段是依然如旧的短片段,还是连接成了长片段。这个实验是先进行标记培养30秒,以后除去同位素继续培养几分钟,再分离DNA在碱中沉淀,检测结果。先合成的(带标记)的DNA不再是短片段,而和总DNA的情况相似,沉淀系数为70S~120S较长的片段,这意味着刚开始合成的片段都是短片段,以后再连接成长片段,人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段(Okazaki fragment)。

原理1978年,Olivera提出了半不连续(semidiscontinuous)复制模型,也就是说前导链上的合成是连续的,只有后滞链上的合成才是半连续的。这是因为细胞内都存在有脱氧胸苷三磷酸(dTTP)和脱氧尿苷三磷酸(dUTP),而脱氧核糖核酸聚合酶Ⅲ(DNA pol Ⅲ)并不能区分这两者,因此会将dUTP加入到DNA中,形成A·U对。但是在DNA中并没有U的存在!因为大肠杆菌细胞里有双重“保险”,防止了U的“混入”。第一道关是细胞里的dUTPase,它能使dUTP变成dUMP,dUMP是不能作为DNA合成的底物,这样它就不再能加入DNA中。但总还有些漏网之“鱼”,它们还是逃过此关,混入DNA中,这就靠第二道关来清除“异己”,这道关的主角是尿嘧啶N-糖苷酶(uracil N-glycosylase),它可以切断混合尿苷的糖苷键,形成无Pu和Py位点(apurinic or apyrimidinic ,AP),再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口,进一步进行切除修复。在细胞内尿嘧啶N-糖苷酶作用较快,而AP酶作用较慢,在新链合成之初约1200bp就有可能掺进一个U,但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切断糖苷键,在AP酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了,用NaOH沉淀时,AP位点十分易断裂,所以前导链也成了小片段。

真核冈崎片段的成熟机制比较复杂,由Polδ、RNaseHI、FEN1、Dna2和DNA连接酶等多种蛋白质协同通过两种机制加工完成。Polδ的3′→5′核酸外切酶活性能替代FEN1,在冈崎片段成熟中通过阻止过量的DNA链替代合成,保证产生能被DNA连接酶连接的具有单一切口两个DNA片段,有利于保持基因组的稳定性。

 
 
 
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