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正负选择系统

王朝百科·作者佚名  2010-04-25
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是基因打靶的常用筛选方法之一。

为了更好地筛选发生同源重组的克隆,1988年Mansour等人设计了正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS), 解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。

理论基础同源重组时,只有载体的同源区以内部分发生重组,同源区以外部分将被切除。随机整合时,是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一,正选择基因多为neo基因,位于同源区内,其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外,位于载体的3’末端,常用HSV-tk基因,在同源重组时,tk基因将被切除而丢失,相反在随机整合时,所有的序列均保留(包括tk)。胸苷激酶蛋白(TK)可使无毒的丙氧鸟苷(GANC)转变为毒性核苷酸,而杀死细胞,因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时,G418和 GANC都有抗性,随机整合时对G418有抗性,但对GANC敏感,细胞将被杀死,无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选,选出含有neo基因的细胞株,再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株,保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因 Neo具有双重作用,一方面导致靶基因的插入突变;同时作为重组细胞的正向筛选标志,该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。除了上述方法外,还可用PCR及Southern杂交法进一步筛选及鉴定中靶细胞。

常用的选择标记基因正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶(neo)、潮霉素B磷酸转移酶(hph)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、次黄嘌呤磷酸转移酶(Hprt)、胸腺嘧啶激酶(tk)及嘌呤霉素乙酰转移酶(puro)。

负选择标记基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)、SacB、 rpsl(strA)、tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、 ccdB等[14]。

正相选择法(positive selection method)麻省理工学院Sharp教授的研究组独辟新径,建立了一种新的同源重组选择方法—正相选择法[15]。这种选择法适用于在靶细胞内正常表达的基因的定点突变。其主要程序是:将选择标记基因 neor的启动子和起始密码剪切掉,再嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内,将打靶载体转染进靶细胞,可能出现下面几种情况:①打靶载体不整合入靶细胞基因组,将随传代而丢失;②外源打靶序列随机整合,由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始密码,整合位点周围亦无启动子,使neor基因的表达受阻;③虽是随机整合,但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子能启动neor基因的表达;④外源打靶载体与靶位点发生了同源重组,则neor基因可借助靶基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。因此,如用G418筛选,则抗性细胞中将只包含后两种可能情况,根据这两种情况下基因组DNA酶切图谱的不一致,用Southern印迹杂交即可检测出同源重组的克隆。

利用正相选择法,Sharp等对NIH/3T3细胞转化而来的MT-1.4细胞系中的癌基因pmt成功地进行了定点突变。之后不久,哥伦比亚大学的 Schwartzberg等用此方法也实现了另一种细胞癌基因c-abl在 ES细胞中的定点突变。最近,利用与正向选择法相似的原理,Jasin等对小鼠T淋巴细胞系CD4位点亦成功地进行了定点突变。

 
 
 
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