定义限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
原理在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
添加原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
附表Fermentas提供的保护碱基数目和酶切活性对应值表
注：酶切活性值出现空格时参考前一格。
内切酶
碱基数目和酶切活性（%）
1
2
3
4
5
AarI
20-50
50-100
AasI
50-100
AatII
0
0-20
20-50
50-100
Acc65I
0-20
50-100
AdeI
50-100
AjiI
50-100
AluI
0-20
20-50
50-100
Alw21I
50-100
Alw26I
50-100
Alw44I
0
20-50
50-100
ApaI
50-100
BamHI
50-100
BauI
0-20
20-50
50-100
BcnI
20-50
50-100
BclI
0
50-100
BcuI
50-100
BfiI
50-100
BfmI
50-100
BfuI
50-100
BglI
20-50
50-100
BglII
0
50-100
Bme1390I
20-50
50-100
BoxI
0
50-100
BpiI
50-100
Bpu10I
20-50
50-100
Bpu1102I
50-100
BseDI
0
50-100
BseGI
50-100
BseJI
0
50-100
BseLI
0
50-100
BseMI
0-20
50-100
BseMII
50-100
BseNI
0
50-100
BseSI
50-100
BseXI
20-50
50-100
Bsh1236I
50-100
Bsh1285I
0-20
50-100
BshNI
50-100
BshTI
20-50
50-100
Bsp68I
0
50-100
Bsp119I
50-100
Bsp120I
20-50
50-100
Bsp143I
50-100
Bsp1407I
20-50
50-100
BspLI
50-100
BspPI
0
50-100
BspTI
0
0-20
50-100
Bst1107I
0-20
50-100
BstXI
0
50-100
Bsu15I
50-100
BsuRI
0-20
20-50
50-100
BveI
0-20
50-100
CaiI
0
0-20
50-100
CfrI
0
50-100
Cfr9I
20-50
50-100
Cfr10I
20-50
50-100
Cfr13I
50-100
Cfr42I
50-100
CpoI
50-100
CseI
50-100
Csp6I
50-100
DpnI
50-100
DraI
0
0-20
50-100
Eam1104I
0
50-100
Eam1105I
0
50-100
Ecl136II
50-100
Eco24I
50-100
Eco31I
20-50
50-100
Eco32I
20-50
50-100
Eco47I
50-100
Eco47III
0
0-20
50-100
Eco52I
0-20
50-100
Eco57I
50-100
Eco57MI
50-100
Eco72I
0-20
50-100
Eco81I
50-100
Eco88I
50-100
Eco91I
20-50
50-100
Eco105I
20-50
50-100
Eco130I
0
50-100
Eco147I
0
50-100
EcoO109I
50-100
EcoRI
50-100
EcoRII
0
0-20
20-50
50-100
EheI
20-50
50-100
Esp3I
50-100
FaqI
0-20
50-100
FspAI
0-20
20-50
50-100
FspBI
20-50
50-100
GsuI
50-100
HhaI
50-100
Hin1I
50-100
Hin1II
0
0-20
50-100
Hin6I
0
0-20
50-100
HincII
50-100
HindIII
0
0-20
50-100
HinfI
50-100
HpaII
0-20
50-100
HphI
0
50-100
Hpy8I
0-20
50-100
HpyF3I
20-50
50-100
HpyF10VI
50-100
KpnI
50-100
Kpn2I
0
50-100
KspAI
20-50
50-100
LguI
50-100
LweI
20-50
50-100
MbiI
0
0-20
50-100
MboI
50-100
MboII
50-100
MlsI
0-20
50-100
MluI
20-50
50-100
MnlI
0
50-100
Mph1103I
20-50
50-100
MspI
0-20
50-100
MssI
20-50
50-100
MunI
20-50
50-100
MvaI
0
20-50
50-100
Mva1269I
0
50-100
NcoI
0
50-100
NdeI*
0-20
20-50
50-100
NheI
0
20-50
50-100
NmuCI
20-50
50-100
NotI
20-50
50-100
NsbI
0
0-20
50-100
OliI
0-20
20-50
50-100
PaeI
0
0-20
20-50
50-100
PagI
20-50
50-100
PasI
50-100
PauI
0
50-100
PdiI
0-20
50-100
PdmI
50-100
PfeI
50-100
Pfl23II
0-20
20-50
50-100
PfoI
0
20-50
50-100
Ppu21I
50-100
PscI
0
50-100
Psp5II
0
50-100
Psp1406I
0-20
50-100
PsuI
0-20
50-100
PstI
0-20
50-100
PsyI
0
50-100
PvuI
20-50
50-100
PvuII
50-100
RsaI
50-100
SacI
50-100
SalI
20-50
50-100
SatI
0
50-100
ScaI
0-20
50-100
SchI
50-100
SdaI
0-20
50-100
SduI
50-100
SfiI
50-100
SgsI
50-100
SmaI
50-100
SmiI
0-20
50-100
SmoI
0
50-100
SmuI
50-100
SsiI
50-100
SspI
0-20
50-100
TaaI
20-50
50-100
TaiI
50-100
TaqI
0
20-50
50-100
TasI
0
20-50
50-100
TatI
0-20
20-50
50-100
TauI
20-50
50-100
Tru1I
0
0-20
50-100
TsoI
20-50
50-100
Van91I
0
50-100
VspI
50-100
XagI
20-50
50-100
XapI
20-50
50-100
XbaI
20-50
50-100
XceI
0
50-100
XhoI
0-20
50-100
XmaJI
50-100
XmiI
50-100
I-SceI
50-100
