siRNA

Small interfering RNA (siRNA)：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。

siRNA原理:

RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶，具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合，形成酶-dsRNA复合体。在Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA（与dsRNA具有同源序列）与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex （RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应。

siRNA有如下特点：

1. 长度约在22nt左右。

2. 依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。

3. 生成需要Argonaute家族蛋白存在。

4. 是RISC组分。

5. siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的。

6. siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。

7. 结构上， siRNA是双链RNA。

8. 在Dicer酶的加工过程中， siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。

9. 在作用位置上， siRNA可作用于mRNA的任何部位。

10. 在作用方式上， siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。

11. siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

siRNA设计时的一些问题：

1） 物种特异性：一般来说，siRNA都具有物种特异性，很少与其他物种有相同的靶位点，所以针对人体基因设计的siRNA不会沉默其他物种的同源序列。然而，也有研究表明siRNA经过特异性设计后能对两个或两个以上的物种有效（人、小鼠、大鼠可能能找到共同靶点，但有效性需进一步鉴定），这需要仔细进行siRNA设计和生物信息学分析。

2） 靶标一般在CDS区选择：siRNA的作用是在mRNA水平，而不是在蛋白质水平。要设计siRNA，需要准确知道靶mRNA序列。由于遗传密码的兼并性和密码子的偏移，不可能通过蛋白序列准确预测核苷酸序列。转录后的RNA前体通过剪接去除内含子序列形成成熟的mRNA。因为siRNA的功能是酶解mRNA序列的，根据基因组序列设计的RNA序列有可能落在内含子区，导致设计的siRNA无效，所以应该根据mRNA序列而不是基因组序列来设计siRNA。

3）siRNA的转染效率：siRNA的分子结构很小，借助转染试剂的帮助一般都能有效转染，但仍有一些例外：神经细胞、干细胞。可以使用荧光标记siRNA来优化转染条件，用流式细胞仪或者荧光共聚焦显微镜即可检测标记的siRNA。

siRNA药物的开发:

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