天然含氮有机化合物（如蛋白质）与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在克氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸气蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量（mol）相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。
因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将克氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。
整个反应过程可分为消化、蒸馏及滴定三大步骤。
样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，氮转变出的氨，进一步与硫酸作用生成硫酸铵，此过程通常称之为“消化”。
但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以加快反应速度。以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下：
CH3NH2COOH + 3H2SO4 → 3CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 （1）
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 （2）
(NH4)2SO4 + 2NaOH → 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 （3）
反应（1）、（2）在克氏定氮烧瓶中完成。反应（3）在克氏定氮仪内进行。
浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨。借水蒸气将产生的氨蒸馏到定量、定浓度的硼酸溶液中，氨与溶液中的氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。最后根据所用标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。