底物水平磷酸化（substrate level phosphorlation）：物质在生物氧化过程中，常生成一些含有高能键的化合物，而这些化合物可直接偶联ATP或GTP的合成，这种产生ATP等高能分子的方式称为底物水平磷酸化
底物水平磷酸化（substrate level phosphorlation）：ADP或某些其它的核苷-5′—二磷酸的磷酸化是通过来自一个非核苷酸底物的磷酰基的转移实现的。这种磷酸化与电子的转递链无关。
指在分解代谢过程中，底物因脱氢、脱水等作用而使能量在分子内部重新分布，形成高能磷酸化合物，然后将高能磷酸基团转移到ADP形成ATP的过程。例如在糖的分解代谢过程中，甘油醛-3-磷酸脱氢并磷酸化生成甘油酸-1，3-二磷酸，在分子中形成一个高能磷酸基团，在酶的催化下，甘油酸-1，3-二磷酸可将高能磷酸基团转给ADP，生成甘油酸-3-磷酸与ATP。
又如甘油酸-2-磷酸脱水生成烯醇丙酮酸磷酸时，也能在分子内部形成一个高能磷酸基团，然后再转移到ADP生成ATP。
底物水平磷酸化指高能化合物的放能水解作用或与基团转移相偶联的ATP合成作用。不包括光合磷酸化或呼吸链中氧化磷酸化的ATP生成过程。例如：糖酵解途径中产生的高能磷酸化合物甘油酸-1，3-二磷酸和烯醇式磷酸丙酮酸在酶的作用下，高能磷酸基团转移到ADP分子上生成ATP。又如三羧酸循环中产生的高能硫酯化合物琥珀酰辅酶A在酶的作用下水解成琥珀酸，同时使GDP磷酸化为GTP，GTP再与ADP作用生成ATP。这些都是底物水平磷酸化的实例。底物水平磷酸化没有共同的作用机制。
不同于：氧化磷酸化（电子传递水平磷酸化）
1. 氧化磷酸化偶联 在生物氧化过程中，代谢物脱下的氢经呼吸链氧化生成水时，所释放出的能量用于ADP磷酸化生成ATP。氧化是放能反应，而ADP生成ATP是吸能反应，这两个过程同时进行，即氧化时偶联磷酸化的过程称为氧化磷酸化。这种方式生成的ATP约占ATP生成总数的80％，是维持生命活动所需能量的主要来源。
2. 电子传递链中ATP形成的部位
3. 影响氧化磷酸化的因素
（1）ATP与ADP的调节作用： ADP/ATP比值下降，说明细胞储备ATP较多，所以氧化磷酸化速度缓慢甚至停止。反之这个比值升高说明细胞需要ATP，于是氧化磷酸化加速进行。
（2）甲状腺素的调节作用： 导致氧化磷酸化增强，促进物质氧化分解代谢，结果耗氧量和产热量均增加。故甲状腺机能亢进的病人常出现基础代谢率（BMR）增高、怕热，易出汗等症状。
（3）氧化磷酸化的抑制剂：氧化磷酸化的抑制剂主要有两类：一是抑制电子传递的抑制剂（呼吸链抑制剂）；另一类是使氧化磷酸化拆离的解偶联剂。呼吸链抑制剂的作用与一定部位的电子传递体结合而阻碍其电子传递。
氧化磷酸化解偶联剂不影响呼吸链的电子传递，但能减弱或停止ATP合成的磷酸化反应。最常见的解偶联剂是2，4-二硝基苯酚（DNP）。
