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差异显示

王朝百科·作者佚名  2009-10-25
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1992年,Liang和Pardee首次提出差异显示技术(DD-PCR),并且利用这一技术克隆了几个基因。由于该技术具有快速、灵敏、简单和可分析低丰度mRNA的优点,很快成为克隆新基因和研究植物基因表达的有力工具。这项技术最初用于医学研究上,近年来已开始在高等植物研究中应用,为研究高等植物的发育、生理代谢、基因表达提供了重要的技术手段。

差异显示的基本原理是,利用一系列的oligo(dT)引物,逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA,通过PCR扩增的方法,转换成cDNA双链,再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,将有差异的片段分开,筛选出目的基因。其技术一般包括下列步骤:(1)从植物组织中提取总RNA,在这个步骤中注意不能有DNA污染,一般用无RNA酶的DNA酶在37℃下处理30 min;(2)在逆转录酶作用下,以Oligo T11MN 为引物(M为G、A、C中的任一种,N为A、C、G、T任一种),进行逆转录;(3)PCR反应,扩增cDNA的第一条链;(4)扩增后的cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,使差异表达的cDNA片段在6%测序胶上分开;(5)找出不同处理间差异显示的条带,从胶上切割下来,并回收,再进行第二次扩增;(6)克隆差异片段,差异片段可作为探针;(7)Northern 杂交,验证目的片段,去掉假阳性片段;(8)对目的片段进行测序;(9)以克隆的目的片段为探针,从基因组文库中筛选出相应的全长基因。

差异显示技术由于充分利用PCR技术和反转录,因此比较快速,且利用该技术能够观察细胞中mRNA的组成,了解植物不同发育阶段或不同环境条件下的细胞之间的差异表达,克隆目的基因。此项技术常用于下列领域:1.基因表达,2.基因的鉴定与克隆,3.研究激素对植物发育的影响,4.研究植物发育过程,5.研究抗病机制,6.研究次生代谢途径,7.研究抗冷机理。

 
 
 
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