南京教案，明神宗万历四十四年（1616年）礼部侍郎署南京礼部尚书沈榷三次参奏在华天主教传教士与白莲教有染，图谋不轨，徐光启上疏辩护不果，七月王丰肃、谢务禄（Alvarus de Semedo 后改名曾德昭）等外国传教士在南京被逮捕，后被押解澳门。十二月庞迪我、熊三拔等人从北京被押解澳门。这是明朝末年西洋传教士在华的第一次重大挫折。
南京教案是基督教在中国所遇到的第一次教案。在南京教案(1616年)以前，中间也有一些教士被当地人民围殴、侮辱、住宅被捣乱、被抓坐牢、被驱逐出境等事件发生。但这都仅属于地方性的事件，影响范围不大，而且很快就平息了。但南京教难却不同，这事在利玛窦死后第六年发生，断断续续维持了好几年，后果是颇为严重的。
南京教案的经过是由当时南京的礼部侍郎沈灌发起的，他一向偏爱佛教，对基督教毫无好感，并且带动一班仇视基督教的人，常常逼迫基督徒。在利玛窦死后，他便蠢蠢欲动，想起来排除基督教。1616年沈灌连上三张奏书给皇帝明神宗，沈灌告传教士的罪状主要有三方面:
一. 控告传教士送礼物给中国人是为了收买人心，以致在适当时候可以倾覆中国。
二. 传教士曾帮助中国修历，推算日蚀、月蚀等日期。沈灌认为传教士以西洋方法治历，违反尧舜一向的做法，是有意变乱中国传统。
三. 沈灌指控传教士破坏儒家文化，教导人不拜祭祖先，这更是中国人不能容忍的。
沈灌上书王帝后，王帝并无反应，因上书理由不足，欠缺力量。加上中国信徒徐光启为传教士辩护，王帝原本也不信沈灌的胡言，事情就不了了之。但沈灌一再上奏，引起各地群众排教。朝廷在压力下，只好下令“禁教”，勒令将传教士驱逐出境。于是传教士有些被杀，有些下在监里，日后又驱逐出境。这时传教士大多撤退到澳门，有些则躲在信徒家中，不能再公开传福音。在外表上教会活动看似停止了，但暗地里工作却未停止。不过这次南京教案，确实带给了教会一定的损失和限制，但在神的保守和恩典下，数年后，教案就平静了。明朝最后的一位皇帝崇祯皇，因推算日、月蚀的士大夫屡屡出错，令崇祯十分不满，于是又准许传教士进中国，天主教在中国又再活跃起来了。
明朝被推翻后，满清入主中国，朝代的改变，并没有影响天主教在中国的发展。南京教案后七、八十年之间，天主教基本上的发展是很顺利的。当时中国十几个主要省分都建立了教堂，信徒人数达一百廿万。但就在教会顺利发展时，传教士之间在礼仪问题上，却产生了很大的争论，使教会受到很大的影响和打击。