454转录组定义使用罗氏454高通量测序技术进行转录组研究的方法。
应用范围和优点适用于 对于没有获得全基因组序列的物种的转录组进行研究。优点是可以得到大量的EST长序列。
技术流程文库构建→→油包水PCR→→454测序流程说明一.文库构建
1) 液氮保存新鲜的组织样品，提取高质量的总RNA;
2) 使用Oligo d(T)柱子纯化mRNA；
3) 改进的3’Primer逆转录合成cDNA（SMART方法）;
改进的3’Primer（加入BsgI酶切位点）为：
5'- ATT CTA GAG GCC GAG GC gtgcag d(T)18 VN -3'
(N=A,G,C,or T;V=A,G,or C)
4) BsgI酶切去除PolyA；
5) 双链cDNA片段化；
6) 连接454特有的A & B接头;
7) 使用磁珠筛选去除接头自连片段;
8) 片段筛选，保留一端是A接头、一端是B接头的片段;
9) 氢氧化钠变性，产生单链DNA文库。
油包水PCR (Emulsion PCR)
1) DNA片段和捕获磁珠混合;
2) 矿物油和水相的剧烈震荡产生油包水环境;
3) DNA片段在油包水环境中扩增;
4) 破油并富集有效扩增磁珠。
二.454 测序
1) PTP准备和清洗;
2) 富集磁珠涂布于PTP;
3) 涂布其他反应成分和包埋磁珠;
4) PTP置于仪器开始测序。
