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致突变试验

王朝百科·作者佚名  2012-03-20
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简介致突变试验即化学致突变物的检测试验,是指对致癌物质进行初筛,是人类预防癌症的重要手段,其中以细菌致突变试验应用最为广泛。

种类基因突变试验1、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

又称Ames试验,检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。试验菌株都有组氨酸突变(his-),不能自行合成组氨酸,在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长,回复突变成野生型后能自行合成组氨酸,可在最低营养平皿上生长成可见菌落。计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。标准试验菌株有四种:TA97和TA98检测移码突变、TA100检测硷基置换突变、TA102对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感。这四个试验菌株除了含有his-突变,还有一些附加突变,以提高敏感性。

试验方法有点试验(预试验)和掺入试验(标准试验)两种。在掺入试验中,受试物最高剂量为5mg/皿或出现毒性及沉降的剂量,至少有五个剂量点,并有阴性(溶剂)对照和阳性对照。将受试物、试验菌株培养物和S9混合液加到顶层培养基中,混匀后铺在最低营养平皿上,37℃培养48小时,计数可见菌落数。判断阳性结果的标准是,如每皿回变菌落数为阴性对照的每皿回变菌落数的两倍以上,并有剂量-反应关系,即认为此受试物为鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。

S9混合液是用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆9000Xg上清液(S9)加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等辅助因子,作为代谢活化系统。如不加S9混合液得到阳性结果,说明受试物是直接致突变物;加S9混合液才得到阳性结果,说明该受试物是间接致突变物。只要在一种试验菌株得到阳性结果,即认为受试物是致突变物;仅当四种试验菌株均得到阴性结果,才认为受试物是非致突变物。

2、哺乳动物细胞基因突变试验 野生型与突变型果蝇的体色

哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验常用的测试系统有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞,中国仓鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的三个基因位点的突变,即次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+/K+ATP酶(OUA)位点。HGRPT和Na+/K+ATP酶位点突变可用于上述三种细胞,OUA位点突变仅适用于CHO细胞,HGRPT和TK可分别使6-硫代鸟嘌呤(6-TG)转移上磷酸核糖及使5-溴脱氧尿苷磷酰化,它们的代谢产物可掺入DNA引起细胞死亡,因此正常细胞在含有这些硷基类似物的培养基中不能生长,在致突变物作用下此两个位点发生突变的细胞对这些硷基类似物具有抗药性,可以增殖成为克隆(细胞集落)。Na+/K+ATP酶是细胞膜上的Na+/K泵,鸟本苷可抑制此酶活性引起细胞死亡,当致突变物引起该位点突变后,Na+/K+ATP酶对鸟本苷的亲和力下降,而酶活性不变,故对培养基中的鸟本苷产生抗药性,并可增殖为克隆。染色体畸变试验1、染色体分析

观察染色体形态结构和数目改变称为染色体分析。在国外常称为细胞遗传学检验,但这一名称有时广义地包括微核试验和SCE试验,因为这两个试验同样也是在显微镜下观察细胞染色体的改变。

对于结构畸变,一般只观察到裂隙、断裂、断片、微小体、染色体环、粉碎、双或多着丝粒染色体和射体。对于缺失,除染色单体缺失外,需作核型分析。即染色体摄影拍片后,再排列进行细微观察或用电子计算机进行图象分析。对于相互易位,除生殖细胞非同源性染色体相互易位外,倒位、插入、重复等均需显带染色才能发现。

对于数目畸变,需在染毒后经过一次有丝分裂才能发现。但是经过一次有丝分裂后,一些结构畸变可能因遗传物质的丢失而致细胞死亡,因此不能发现。所以应安排多次收获时间,以便分别检查断裂剂的作用。收获时间的安排还应考虑外来化合物可能在细胞周期的不同时期产生作用,以及延长细胞周期的作用。

体细胞的染色体分析可作体内或体外试验,体内试验多观察骨髓细胞,体外试验常用中国仓鼠肺细胞(CHL),以及中国仓鼠卵细胞(CHO)和V79等细胞系,但任何细胞系的染色体皆不稳定,不能准确地观察非整倍体,故在体外试验中,如考虑进行染色体数目观察,应当使用原代或早代细胞,例如人外周淋巴细胞。体内试验与人体实际接触情况相似,但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。体外试验由于受试物与细胞直接接触,故往往比体内试验灵敏。

2、微核试验 微核试验

经致突变物作用后,染色体无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体在细胞分裂的后期仍留在子细胞的胞质内,成为一个或几个规则的次核,称为微核。常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段,此时红细胞的主核已排出,微核容易辩认,PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别,故为骨髓微核试验的首选细胞群。常用小鼠,至少设两个处理组,最高剂量为LD50/7的80%(LD50/7为在7天内使半数动物死亡的剂量),另一组为LD50/7的40%,灌胃或腹腔注射,同时设阴性和阳性对照组,每组至少8只动物,雌雄各半。给毒方案有多种,如连续四天,每天一次。第五天处死,取骨髓,涂片,固定,染色。每鼠计数1,000个PCE的微核出现率。当经适当的统计学分析,处理组微核率显著高于阴性对照组,并呈现剂量-反应关系时,可认为受试物对该试验动物的骨髓细胞有致染色体损伤的作用。DNA损伤试验1.姐妹染色单体交换(SCE)试验

SCE是染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换,SCE可能与DNA的断裂和重接有关,提示DNA损伤。SCE试验可分为体外试验、体内试验和体内、体外结合试验。体外SCE试验可采用贴壁生长的细胞,如CHO、V79、CHL等,也可用悬浮生长的细胞,如人外周血淋巴细胞。细胞在含5-溴脱氧尿苷(BrdU)的培养液中生长两个周期。由于Brdu是嘧啶类似物,可于合成期中掺入DNA互补链,所以在下一个中期所见染色体姐妹染色单体之间各有一条互补链掺入了Brdu,于是Brdu对称姐妹染色单体造成同等的干扰,其染色并无区别。但到了第二个周期中期相,每个染色体中只有一条染色单体保留了原来不带Brdu的模板链,而另一条染色单体则是上一周期带Brdu的互补链成为模板链。于是经两个周期的Brdu掺入互补链可使两姐妹染色单体所含Brdu量不相等,从而出现染色差别。如果Brdu仅在第1周期掺入,第2周期不掺入,则第2中期相似可见姐妹染色单体染色有差别。如果DNA单链发生了断裂,而且在修复过程中发生重排,就在第2周期可见姐妹染色单体同位节段的相互交换。经差别染色后,可观察到两条明暗不同的染色单体。若两条染色单体间发生等位交换,可根据每条染色单体内出现深浅不同的染色片段进行识别和计数。

2.程序外DNA合成试验

基本方法是测定S期以外3H-胸苷掺入胞核的量,这一掺入量可反映DNA损伤后修复合成的量。由于此种合成发生在DNA正常复制合成主要时期以外,故称为程序外DNA合成(unschedule DNA synthesisUDS)试验或DNA修复合成试验。一般使用人淋巴细胞或啮齿动物肝细胞等不处于正在增殖的细胞较为方便,否则就需要人为地将细胞阻断于G1期,使增殖同步化。然后在药物的抑制下使残存的半保留DNA复制降低到最低限度,才能避免掺入水平很高的半保留复制对掺入水平很低的程序外DNA合成的观察。试验结果的评定阳性结果各种致突变试验都有其特定的观察终点,但实验结束后都面临一个共同的问题,即所取得的数据表示阳性结果或表示阴性结果。

在评定阳性或阴性之前,应首先检查实验的质量控制情况。致突变试验的质量控制是通过:①盲法观察和②阴性对照和阳性对照的设立。盲法观察是观察人员不了解所观察的标本的染毒剂量或组别,可免除观察人员对实验数据产生主观影响。阴性对照指不加受试物的空白对照,有时则是加入为了溶解受试物所用溶剂的溶剂对照。阳性对照是加入已知突变物的对照,对于体外试验应包括需活化的和不需活化的两种已知致突变物。空白对照应和溶剂对照的结果一致,如有显著差异则可能表明有实验误差,如溶剂对照结果显著高于空白对照则可能溶剂具有致突变性。阴性对照和阳性对照结果都应与文献报告或本实验室的历史资料一致。如差异较大也说明可能有实验误差。发现这些质量控制指标存在任何疑问时,均应查清存在的问题,并加以解决后,重新进行实验。

阳性结果应当具有剂量反应关系,即剂量越高,致突变效果越大,并在一组或多组的观察值与阴性对照之间有显著差异。如果低剂量组或低、中两剂量组与对照组之间的差异有显著性,而高剂量组差异无显著性,则阳性结果不可信或无意义。此时应检查影响实验的因素,在排除影响因素后,应考虑是否为剂量反应关系曲线的特殊形式所致,即曲线上升至一定程度后下降。如怀疑及此,应当在零剂量与最高观察值的剂量之间重新设计染毒剂量。阴性结果阴性结果的判定条件是:①最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大,则体内试验和细菌试验应为最大耐受量,使用哺乳动物细胞进行体外试验,常选LD50或LD80为最大剂量。溶解度大,毒性低的化学物,在细菌试验中往往以5mg/皿作为最高剂量。②各剂量的组间差距不应过大,以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些外来化合物。

无论阳性还是阴性结果都要求有重现性,即重复试验能得到相同结果。

 
 
 
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