抑制差减杂交（SSH）SSH是一种基于抑制PCR和差减杂交技术建立的,在转录水平上研究基因表达的技术,具有稳定、高效、可靠的特点,可对生物的生长、发育、衰老、死亡等生命过程及生物或非生物逆境胁迫对生物所造成的影响等进行全面、系统的分析。
抑制差减杂交( suppression subtractive hybridization, SSH)是基于抑制PCR和差减杂交技术建立的简单有效的方法[1],通过一次差减杂交可使低丰度的序列(mRNA)得以高于1000倍的富集,有效的选择性扩增目标序列,同时抑制非目标序列的扩增,因此在分离基因特别是分离低丰度差异表达基因方面具有更广阔的应用前景。
抑制差减杂交技术运用了杂交二级动力学原理,即高丰度的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度快于低丰度的单链cDNA,在试验组(tester)和驱动组(driver)的cDNA变性后再复性的过程中,原来在丰度上有差别的单链cDNA达到均一化。同时,由于试验组的cDNA在进行杂交之前等分的两份加有不同的接头,因此杂交时将产生5种不同类型的分子a、b、c、d和e(图1),当采用与两个不同接头序列互补的引物进行PCR扩增时,只有目标序列得到有效扩增,非目标序列因两端存在反向重复序列,退火时易产生类似”锅柄”的结构,无法与引物配对,扩增受到抑制。
抑制差减杂交(SSH)技术的主要步骤有:(1)cDNA的合成与酶切;(2)试验组cDNA分成两份,并与两个不同的接头连接;(3)试验组的cDNA与过量的驱动组cDNA杂交;(4)选择性PCR扩增与接头相连的试验组cDNA分子;(5)克隆PCR产物,构建差减文库;(6)筛选文库。
SSH方法一般只用于两个样品的差异比较分析,样品间的差异不宜太大或太小,而对于多个样品则无能为力,这在很大程度上限制了它的应用。提取tester RNA的时期非常关键,选择使用该方法时,首先要根据不同的研究目的确定取材的最佳时期,取材时期不当将会给试验带来意想不到的困难,或许只得到很少几个差减克隆或根本得不到克隆,或得到一些非目的克隆。从技术本身讲,提取的tester RNA和driver RNA及从中分离的mRNA的质量、限制酶的酶切效率、接头的连接效率、第二次PCR产物的转化效率及差减克隆的筛选方法等关系着验的成败。另外SSH所需的起始RNA量较大,一般为几微克,对于一些珍贵稀有的不易获得足够RNA的材料要慎重使
用。
SSH方法在研究植物基因的差异表达方面已得到有效应用,该方法在应用范围和深度上可进一步拓宽和加深:(1)利用SSH方法研究生物(如细菌和真菌等)和非生物逆境(如干旱和寒冷等)对植物的影响及生物与寄主植物的互作时,可进一步提早取材时期(如逆境诱导后的6小时或更早)和缩短取材间隔,以获得植物差异表达基因的表达动态和进行有关转录因子等方面的研究,进而获得植物与逆境互作的关键点,更好地理解其互作机制,为从分子水平上定向培育抗旱、抗寒、抗病等作物提供更可靠的理论依据。(2)将获得的一些差异表达基因片段转化为分子标记,进行标记辅助选择,进一步为育种服务。(3)衰老、凋亡同生长、发育一样也是植物的重要生命活动过程,利用SSH研究了解作物的衰老、凋亡机制,适当有效地延长或缩短作物的生命周期,对于提高作物的生物产量和经济产量均具有重要意义。就马铃薯育种研究工作而言,工作重点主要集中在抗逆(如抗病、抗旱等)、品质及产量等方面,利用该方法可进一步了解其机制,将所获得的相关基因转化为分子标记等,可加速马铃薯抗逆、品质改良和产量等方面的育种研究进程。目前我们实验正在应用该项技术进行马铃薯青枯病抗性相关基因的分离工作,并拟建立病菌诱导后特定时期的基因表达谱,以初步揭示其抗性机制,为今后顺利开展马铃薯抗青枯病育种奠定基础。(4)基因的协同表达是植物分子生物学研究的一个重要领域,SSH方法在转录水平上作为研究生物基因表达的重要方法,可为研究者展示所研究生物某一特定时期的基因表达轮廓,此领域的研究将成为今后植物分子生物学研究的一个热点。
