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反向PCR

王朝百科·作者佚名  2010-02-06
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PCR只能扩增两端序列已知的基因片段,反向PCR可扩增中间一段已知序列,而两端序列未知的基因片段不扩增。

反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA,也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列,因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补,但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA,然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子,通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段;现已制备了酵母人工染色体(YAC)大的线状DNA片段的杂交探针,这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

该方法的不足是:①需要从许多酶中选择限制酶,或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列,而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列,这样,通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析,探索邻接已知DNA片段的序列,并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆,建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。

用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定,目前,PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下,首先 需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游 或上游区,而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增,并带有由内切酶和环化类 型决定的接点(例如,互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列,初试时 最好靠近识别上个碱基位位的酶,并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向 PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针,建议事先在载体中引入 合适的酶切位点。

用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中,为产生对反向 PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶,但这样所产生的片段末端则不适于连接,环 化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理(钝化)。连接前,需用酚或热变性使内切 酶失活。

聚合酶链反应条件与经典所用的相同,例如,94℃-30秒变性,58℃-30秒引物退火, Taq聚合酶70℃延伸3分钟,进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时,与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用,它使测序引物扩增部 分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近,减少了扩增引物的干扰。

 
 
 
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