永禄五年（1562），弗洛伊斯作为传教士来到了日本，先是在北九州地方传道，永禄七年（1564）受命赴京都，帮助在那里传道已7载的伽斯帕尔·比勒拉神甫。在此期间，他对京畿地方的文化及风俗作了极为详尽的记述。后来，他被赶出京都，在界港避难四年。其被赶出的原因不的而知，但其离开京都的永禄八年（1565）正是三好家与松永久秀共同谋杀了十三代将军义辉及其一族，另立足利义荣为十四代将军的时候，在纷乱之时，也势必遭到一些保守势力趁机迫害。永禄十二年（1569），路易斯·弗洛伊斯在日传教的转折点就在此时，战国枭雄——织田信长在平定了六角家，击败了三好家后拥立了足利义昭为征夷大将军后，苦于本原寺的一向宗佛教势力，出于对天主教采取扶植政策以对抗本愿寺的目的，在歧阜城召见了路易斯·弗洛伊斯，这是路易斯·弗洛伊斯第一次谒见信长公.在这次会见中路易斯·弗洛伊斯进献了许多珍稀的南蛮风物，使得信长大为高兴，并受到了优遇和保护。其后在传教方面取得了重大成果。
天正四年（1576），他移居丰后，主要在大友义镇的手下生活了四年。由于耶稣会巡查员亚历山大·步瓦利尼亚诺来到日本，佛洛伊斯作为翻译再次前往京都，于天正九年（1581）第二次谒见织田信长，接着，还在越前国北之庄访问了高山飞弹守右近。这也是传教士首次来到越前。
在本能寺事变之后天下局势发展已露端倪的天正十四年（1586），佛洛伊斯随同副教区长伽斯帕尔·柯厄略巡视各地，并前往大阪谒见丰臣秀吉，受到款待，也取得了秀吉对天主教在日本传播的支持。翌年，丰臣秀吉讨伐九州后，看到天主教在九州大名和民众中的强烈影响时感到不安，深恐产生一向宗那样的号召力，接着就颁布了著名的“传教士追放令”，后来，佛洛伊斯主要住在加津佐、长崎等地。
庆长元年（1596年）八月西班牙商船圣·菲利浦号遭风暴袭击漂流至土佐浦户，其中一船员向前来例行检查的京都所司代前田玄以口出狂言，说西班牙先用教士驯化民众，而后进行征服，秀吉闻知此言后勃然大怒，以致于当年十二月就在长崎将方济阁会的传教士和日本信徒26人处决，即所谓"庆长大殉教"。这成为日本迫害天主教的开端。而目睹了此事件的路易斯·弗洛伊斯也于该年底与世长辞，享年六十五岁。
后世评价
路易斯·弗洛伊斯是最早来到日本的欧洲传教士之一，他在日本长期居留达几十年，是一个有名的“日本通”。在日期间，他勤于著述，留下了大量的报告和著作，留下了大量的长篇报告，著有大部头的《日本史》和比较类的《日欧文化比较》以及详尽的《耶稣会士日本通信》。其详实的著作为后人研究当时的日本文化历史及东西方文化交流做出了杰出的贡献，其本人筚路蓝缕之功也将永不泯灭！
