双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
切口平移法(nick translation)当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。
切口平移反应受几种因素的影响:
(a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。
(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli
DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。
(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。