在1866年爆发了普鲁士与奥地利争取统一德意志领导权的王朝战争。
1863年末，丹麦合并了属德意志联邦的施列斯维希和霍尔施泰因。次年初，俾斯麦以此为由对丹麦作战。奥地利亦随之参战。丹麦以4万士兵对6万联军，结果战败。普鲁士得到了施勒斯维希。奥地利也得到了霍尔施泰因。
在对丹麦战争获胜后，普鲁士积极展开行动，试图打败统一德意志过程中的最大敌人奥地利。1866年6月7日，普鲁士用普、奥两国有权力共同占领石勒苏益格与荷尔斯泰因两公国为借口，把军队开进了由奥地利管制的荷尔斯泰因。奥地利对此作出强烈的反应。6月14日普奥战争爆发了。意大利加入普方作战，但德意志各邦国大多数都支持奥地利，像巴伐利亚、汉诺威、萨克森、符腾堡和黑森等邦。战争开始时局势对普鲁士很不利。但在俾斯麦的领导下，战局发生扭转，7月3日，双方在萨多瓦展开了决战，普军投入了23.8万人，奥军为29.1万人。虽然奥军在人数上占有一定优势，但普军大规模装备和使用了来复枪导致奥军大败，普军开始进逼维也纳。由法国出面调停，于8月23日签订了《布拉格和约》。战争前后一共七星期(6月7日—7月26日)。因此这场战争也叫“七星期战争”。按照和约，普鲁士获得了霍尔斯坦因、汉诺威和法兰克福自由市等地，奥地利退出德意志联邦，并且同意解散联邦。成立了在普鲁士领导下的由莱茵河以北由诸邦组成的北德意志联邦。普鲁士承认了南德意志各邦的独立。北德意志联邦在1867年成立。这是普鲁奥战争最主要的结果，是普鲁士统一德意志走出的决定性一步。
