Rhino
游戏中的第一个Boss，被章鱼博士Doc Ock从监狱里放出来。它拥有18吨的握力和坚硬无比的外壳，完全属于正统的力量型怪物。虽然力量巨大，但是它的攻击方式并不是很有效。首先是要对付它双手锤击地面的振荡波，这一招的攻击范围很广，几乎是全范围伤害，在地面上绝对会吃这一招的亏。
这时候需要高高跳起，或者用蜘蛛丝粘在墙上就能够躲开振荡波的攻击范围。Rhino使用振荡波攻击也会对自己造成很大的负面影响，使用后会出现一段时间的头晕，这个时候就可以冲上去狠狠揍它。比较理想的方法是用二段跳躲开振荡波攻击后，在空中发射蜘蛛丝到它身边，用ZIP拉近，然后就在它头上施展连环空中踢击。
受伤害到一定程度后，它会冲到十字路口上被警察设立的防御网困住。进了包围圈之后，它就不再使用振荡波攻击了，而会使用冲刺攻击。它会利用它头上的尖角和强劲的脚力向蜘蛛侠顶去，因为前冲的速度很快，要想用跑动避开很困难。这时同样可以跳上空中，用二段跳远远避开。当它的角重重的撞上防御网上也会让它自己头晕，要攻击就要趁这个时候。
继续在空中施放蜘蛛丝，用ZIP拖近然后施展连环踢击。不过这一次对抗不能将它杀死或抓住，章鱼博士会趁火灾的混乱将它拖走。所以在这之后还会在之后的冷冻室遇见一次Rhino，在那里并不需要直接地攻击它，引诱它去撞击高压电设施就能够伤害到它的HP。可以站在设施前等它冲刺的时候再跳起避开，也可以选择躲在设施后面露出半个身体，这样是完全不会给它机会撞到自己，不过要注意自己所站的位置不要靠设施太近。
章鱼博士Doc Ock（银行）
章鱼博士是一个性格非常复杂的科学家，他致力于研究新的可动机械爪，这项发明具有极高的军事和民用价值。后来他在众参观者面前展示发明，亲自将机械爪装甲披在身后，但装甲的不稳定性也渐渐显示出来，博士终于在实验中走火入魔，成为疯狂又偏激的反派人物。而那机械爪装甲也和他融为一体，章鱼博士因此而得名。
章鱼博士会施展自己的四条机械爪向蜘蛛侠进攻，速度飞快而且准确，如果被击中会被弹飞很远，攻击力也非常高，蜘蛛侠会受到很大的伤害。但是他的机械爪攻击也有弱点，在银行的金库中经常会被卡在金库的地板里，这个时候就可以避开他的机械爪向他本身攻击。章鱼博士还有一个攻击方式是打开他自己头顶的金库防盗设施，让整个金库通上高压电。蜘蛛侠会受到电击的伤害，在整个金库中只有一处不会受到电击。在进门方向的左边有一堆金块被搬空了，只留下放金块的木板，这块木板上是没有电流通过的。跳起后用蜘蛛丝瞄准这里用ZIP拖近是最快速准确的方式。站稳以后，可以用蜘蛛丝瞄准章鱼博士头顶上的电源开关，按左键施放出去以后就可以将电源关掉。
彪马Puma
原名托马斯·火心（Thomas Fireheart），原来是火心实业的CEO，变异后拥有不输于蜘蛛侠的感官和反射神经，而且拥有很多战斗技巧和拳法。但是对拥有超能力的身体战斗还不是很习惯。和他正面对战需要注意使用躲避键，一直按躲避键根本不会被打中。不过要注意他的攻击是连续的多次攻击，必须等他一连串攻击全部打完以后再进行反击。当他一连串攻击完成后，会在短暂时间出现破绽，这个时候就可以放掉闪避键，换用拳头招呼他。外星人Mysterio
一个外星人，能够使用超能力将岩石举起然后向蜘蛛侠砸去，而且他飞在半空中时无法被拳头直接攻击到。在下面四处跑动就能够轻松地躲开飞来的岩石，注意向他脚下的位置跑动，以便利用岩石攻击他。等他攻击完一波后就会暂时停止攻击，然后举起落在附近的岩石向他扔过去就能够攻击到他。
接着他会逃到自己的太空船里。太空船有导弹和激光两种攻击武器。对付导弹可以躲在四周的大厦废墟里找一些不会被导弹攻击到的死角，然后用子弹攻击导弹发射器。当一个导弹发射器被摧毁以后，太空船就会发出激光。躲在废墟的墙角不会被激光打中。激光发射完后，太空船的上部就可以用子弹攻击摧毁它，Mysterio就重新暴露在空气中。跳起发射蜘蛛丝用ZIP靠近他，用拳脚攻击他。重复几次就能够将他打死。
章鱼博士Doc Ock（火车）
在火车上的章鱼博士几乎疯狂地将下面的一些巨型垃圾扔过来，因为在火车上无处躲避，蜘蛛侠要在被它们打中之前用子弹将它们一一打飞掉。这里的重点是要手脚敏捷，快速地瞄准空中飞来的目标攻击。注意一些体积超大的东西后面可能会隐藏着其他东西，被打掉后要继续攻击。当章鱼博士使用机械爪将火车关节拆掉的时候就要快速跳起，空中发射蜘蛛丝用ZIP到达下一节车厢。
章鱼博士Doc Ock（工厂）
在工厂里的章鱼博士会利用身边的一些塑料桶扔向蜘蛛侠，让蜘蛛侠很难靠近。用子弹攻击他四周装有液体的坑洞能够导致下面的火炉发生剧烈反应让章鱼博士暂时停止攻击。就可以乘机冲上前去攻击他。但是章鱼博士扔塑料桶几乎让没你有空余时间来进行还击。不过在工厂上方有很多横梁，它们都可以作为阻挡塑料桶的屏障，而直线攻击的子弹则完全不会受到这些横梁的影响，可以安心的在它们的保护下攻击装有液体的坑洞。
