南京博物院是我国最早创建的博物馆之一。南京博物院之前身是1933年由我国近代民主革命家、教育家，时任国主中央研究院院长的蔡元培先生倡议创建的国主中央博物院筹备处。蔡先生亲自兼任 第一届理事会理事长，在中山门半山园征地12.9公顷，原拟建“人文”、“工艺”、“自然”三大馆，后因时局关系，仅建“人文馆”，即现在的南京博物院大殿。当时通过收购、拨交、发掘，集中全国第一流珍品约二、三十万件，其中包括绘画中的《历代帝后像》、《唐明皇幸蜀图》；铜器中的《毛公鼎》、《司母戊鼎》等稀世国宝。一批著名专家云集于此，如李济、吴金鼎、夏鼐、曾昭燏、王天木等。在抗日战争内迁西南期间，进行考古发掘、民族调查，并出版有《云南苍洱境考古报告》、《么些象形文字字典》、《博物馆》等许多专著。北平历史博物馆曾一度归属于中央博物院的建制而成为分院。当时为全国唯一一座仿照欧美第一流博物馆建馆的现代综合性大型博物馆，直属当时的教育部领导。
1949年新中国成主后，南京博物院进入一个新的历史阶段，仍称“国立中央博物院”，直接由中央文化部领导， 1950年3月9日经文化部批准正式改为“国立南京博物院”，性质仍是全国综合性历史艺术博物馆，由文化部文物事业管理局领导，经费由中央拨款，任务由文化部直接布置，如南唐二陵发掘，六朝陵墓调查等。
1950年7月改由华东文化部领导，属华东大区博物馆，包括东南地区五省一市（江苏、安徽、浙江、福建、台湾、上海），还建立华东文物工作队，队部设在南京博物院，这期间发掘了山东沂南汉画像墓、安徽寿县春秋时代蔡侯墓、浙江杭州老和山新石器时代遗址、福建闽侯昙石山新石器时代遗址，还奉命派人到郑州协助发掘商代遗址。
1954年9月华东大区撤消后，南京博物院改由江苏省政府文化局领导，属全国综合性历史艺术博物馆，是全国重点博物馆之一。
藏品中较珍贵的有：吴县草鞋山和武进县寺墩等新石器时代良渚文化遗址出土的一批玉琮、玉璧；丹徒春秋墓出土的尸祭缶，器盖铭文记载着吴国三代四王的名字；盱眙南窑庄发现的陈璋壶，为战国时代齐国获自燕国的王室用器，全器由器身和外套合成，外套稍残，饰96条卷曲起伏的长龙和576枚梅花钉，横箍上饰错金流云纹，壶口沿和圈足外刻有表示其容量等的铭文。同出的金兽，出土时盖于铜壶之上，长17.8 厘米，通高 10.2厘米，重9000克；南京郊区出土的南朝模制砖画《竹林七贤》。在3万多件宋、元、明、清书画中，以明、清两代的藏品见长，画派较全，佳作较多。精品包括宋朱熹与某侍郎书札卷、元黄公望《富春大岭图轴》、元吴镇《松泉图卷》、 明徐渭《杂花图》卷、明文征明《中庭步月图轴》以及清龚贤的《水墨溪山烟树图轴》等。另有代表11个民族的民族文物2233件。还有相当数量的明清碑刻资料和近现代珍贵历史文献，如仅抗日战争和解放战争时期江苏地区的革命文物资料等就有 1.7万多件。
该院有9个陈列厅，面积3712平方米。其中7个厅设有基本陈列“江苏历史陈列”，展示了江苏地区从原始社会到近代的数千年历史发展的历程，着重反映了江苏地方历史的文化特色。另两个厅每年举办10个以上重要文物、绘画和工艺品展览。该院还举办流动展览，如深入工厂、农村进行宣传，配合国际文化交流活动，到日本等国举办“南京博物院艺术展”等。此外，该院还举办了近代史专题讲座，到大中学校、工厂讲课，通过电台、电视台和报纸进行历史、文物、绘画艺术等知识的普及工作。也聘请院内外专家、学者讲授各种专题历史知识。
该院编辑出版的大型专著、图册有：《南唐二陵》、《沂南汉画像石墓发掘报告》、《中国博物馆》大型丛书《南京博物院》、《南京博物院藏画》、《南京博物院藏画选集》，以及《江苏明清碑刻资料选编》、《江苏彩陶》、《元朝艺术》等数十种。定期出版的刊物有《南京博物院》(年刊)。该院还是江苏省考古学会、江苏省博物馆学会、 江苏省民俗学会的常设机构所在地，与3个学会联合出版学术刊物《东南文化》。
