出入境木包装松材线虫检疫创新技术的研究(中)
2、线虫分离技术
传统的线虫分离方法主要是贝尔曼漏斗法和浅盘法。漏斗法的优点能在分离液中直接获得线虫，缺点是样品不能均匀散布，样品量相对较小，获得的线虫量少，线虫分离率较低；浅盘法的优点能使样品均匀散布，线虫分离率高，缺点是获取线虫要过筛，筛网由于经常使用，常会由于霉菌的作用及一些微小的杂物而堵塞，致使过筛速度非常缓慢。不适应口岸经常、批量性使用。
我们结合口岸工作的特点，将两种线虫分离方法的优点结合起来，针对木包装松材线虫检疫工作的特点，创造了“改进型线虫分离器”（专利号：ZL 01 2 72572.2）其技术特征如下述。
2.1线虫分离器制作及样品要求
线虫分离器主体为有机玻璃模压制品，由4部分组成。第一部分为漏斗盛放样品，内套一只Φ1 6cm/10目，不锈钢网筛。考虑到木包装样品比重较小，浮在水面的特点，加大了漏斗上层的容积，最多一次能分离200g木样，正常制样20-60g，样品锯成长1-2cm ，劈成厚0.3cm以下的小薄木片，分离线虫效果较为理想。样品均匀散布在漏斗的表层，样品分离后，可将不锈钢套筛取下，倒去里面的木片；第二部分为底座，起支撑作用；第三部分为止水夹，为分离线虫的出口；第四部分为软管，起连接和暂时存放线虫的作用。线虫分离器分离线虫时，夏季自然放在室内，冬季可以移入保温保湿培养箱中，以保证分离线虫所需要的温度。
2.2取消滤纸或纱布
传统的浅盘法与贝尔曼漏斗法分离线虫，分别使用滤纸，纱布作为过滤层防止杂物污染线虫，以免造成观察困难。用薄木片法制出的样本，基本无杂质，取消滤纸和纱布不影响观察效果，从而使分离线虫的方法变得更加简单。
2.3定性与定量分析
由于分离器法分离线虫采用了两种分离线虫方法的精华，使得定性更准确。如采用浅盘法，在过筛时，若线虫量非常少时，很可能得不出准确结论。漏斗法样品量少，不能均匀散布，也得不出准确的结论。而我们采用的方法，线虫可以直接沉积到止水夹处，轻轻放出即可检查有无线虫，是什么种类的线虫。对一个样品进行连续定时的线虫分离就能分析出线虫从样品中的逸出规律。此法提供了准确而简捷的线虫定性定量分析方法。
2.4快速分离线虫
传统方法要求，在250℃条件下，分离线虫的时间为24小时，而用我们的制样方法和线虫分离器，6小时左右就能准确进行线虫的定性分析。经过我们在同等条件下的反复试验发现，3小时就能发现线虫，12小时能分离出样品中线虫量的40-70%。有鉴于此，我们将一份样品，制成2到3份小样进行线虫分离，这样就能使正常的线虫分离时间缩短3/4，提高工作效率和集装箱验放速度。
3、无片鉴定技术
为了适应口岸快节奏、大批量、以及进境木包装中线虫混生，需要大量制片观察的特点，我们在工作实践中，逐步探索，敢于打破常规，从而形成了松材线虫的无片鉴定技术。其要点就是通过显微镜直接观察凹皿里的线虫悬浮液，直接确定悬浮液里是否有松材线虫。此法在连云港、南京、扬州等口岸使用，效果明显。具体做法如下：用凹皿盛放改进型分离器放出的线虫悬液少许，5滴即可，无需在酒精灯上加热杀死线虫，将凹皿直接移放在普通光学显微镜下观察，先用低倍镜调整焦距，找到线虫，然后再由接物镜的4倍镜头移至10倍镜头观察，此时，一手移动凹皿，不断变换所观察线虫的位置，一手不断调整焦距，以达到所观察的线虫清楚为止。在10倍的接物镜下，松材线虫的一些基本特征如：头部、中食道球、阴门、交合刺、尾形等都能观察。需要强调的是解剖镜还是必需的。如果认为分离液里的线虫可能是松材线虫，则需杀死、固定、在解剖镜挑取线虫制片，进行详细的特征观察。直接用显微镜观察凹皿里线虫的方法，对提高松材线虫疫情检出率，有着非常重大的意义。从我们工作的实际来看，木包装里发现松材线虫有其自身的特点，一是量少，二是混生。用常规的方法，挑虫制片，对于少量的线虫，制几个片子观察，不怎么麻烦。如果里面混生大量的往显得力不从心。然而，在显微镜下直接对线虫分离液进行观察鉴定，可以将凹皿里所有线虫随意观察。工作效率可提高几倍仍至十几倍，甚至更高。有条件的可在倒置显微镜下观察，效果更为理想。
