MicroRNA在人体发育过程中起着意想不到的作用。
法国科学家称核糖核酸沉默机制（RNA silencing）能够抵抗人体中的病毒，不可思议的是，小RNA (miRNA)竟然是组成这一机制的基础。
“科学家一直认为miRNA与调节内源基因有关，而小分子干扰核糖核酸（iRNA）能够控制外源基因，尤其是病毒RNA基因，”该文的主要作者、来自法国斯特拉斯堡的植物分子生物学院的查利斯·亨利·莱西利亚在《科学》杂志上说道。
科学家们先前的研究显示，核糖核酸干扰（RNAi）能够消灭植物以及昆虫体内的病毒，但目前还没有研究表明它在脊椎动物也拥有类似功能。自从科学家们发现RNA沉默机制能够压抑内生反转录病毒，使其无法在植物、酵母、蚯蚓以及苍蝇等等体内游动，莱西利亚和他的同事就推断哺乳动物体内的外源病毒基因的反转录移位功能应当也是同样脆弱。因此他们选择了一种原始的1型泡沫病毒（PFV-1）——一种与人体免疫缺损病毒（HIV）同类的逆转录酶病毒——作为实验的模拟系统。
由于P19沉默干扰基因的表达，PFV-1病毒在人工“人体胚胎肾脏细胞株”（human embryonic kidney cells）中聚集并且变得十分明显。这意味着，由于P19细胞控制着siRNA和miRNA，而且这两种核糖核酸的路径也控制着PFV-1在人体细胞中的繁殖。
为了确定人体RNA沉默机制的具体作用，研究者们将PFV-1病毒所含有的病毒基因序列与一种附有报告基因绿色荧光蛋白（GFP）链接在一起，然后使它们与人体胚胎肾脏细胞一起染上病毒。报告显示，F11架构中的绿色荧光蛋白与F11mRNA聚集中所含有的绿色荧光蛋白比例完全不同。这一点使研究者们想到了miRNA转录抑制。利用DIANA-microT运算法则计算后发现F11序列与人体miR-32具有高度的相似性。
进一步的研究表明，miR-32沉默受到P19表达细胞的压抑。同样，受抗miR-32细胞控制的核酸低聚核苷酸使子代病毒的繁殖量增加了一倍，并不是像抗miR-32细胞所起的作用一样。这意味着miR-32起着直接反病毒作用。
植物与昆虫中，所有的核糖核酸干扰（RNAi）能够消灭的病毒都含有可以抑制核糖核酸沉默的蛋白质。而在后来的研究结果显示，PFV-1中含有一种叫做Tas的病毒反激活蛋白。
一种叫做“阿拉伯芥”的植物中，转基因Tas能够大量减少siRNAs，并且使干扰基因引发的细胞产生发育变异现象，同时干扰miRNA的功能，例如植物叶子变长、长出锯齿等。这意味着Tas具有抑制miRNA 和siRNA某种基本功能的作用，而这种功能是植物与哺乳动物共同拥有的。
类似Tas的另一种蛋白质，AC2，其中含有植物基因病毒，也是一种病毒反激活蛋白，同样能够压抑RNA沉默机制。
目前，研究者们认为每种类型的细胞都有自己独有的miRNA细胞库。莱西利亚说：“这样的概念能够部分解答一些有关病毒反应方面的问题。”他认为，在细胞种类中，优先繁殖的病毒是处在抗病毒miRNAs没有表现的地方，或者表现并不明显的地方。
MiRNA的反应也会导致基因准种群出现，如果病毒能够快速使其基因组发生变异，例如HIV与流感病毒，它就能避免受到miRNA沉默机制的影响。“基因准种群的出现对于躲避抗病毒功能的影响是十分重要的，因此研究这种miRNA反应也十分重要，” 莱西利亚说。
这一研究小组并没有发现人类细胞能够利用siRNA来消灭病毒。“所以研究哺乳动物是用还具有利用siRNA来对付病毒的能力是一个十分有趣的课题，因为与蚯蚓、苍蝇这些昆虫相比，哺乳动物拥有更加先进的免疫系统，”麻省理工大学的飞利浦·赛摩说。他并没有参加这次研究活动。虽然miRNAs是否是抗病毒反应的原因之一，或者只是偶然对病毒核糖核酸起到了沉默作用，但是他认为：“不论miRNAs的表达是否会抑制病毒传染，这项研究都会引起科学界的广泛关注。”
美国加州大学的丁守维（音译）称，未来的研究方向可能会包括测试几百个人体microRNAs对诸如HIV病毒和流感病毒等病毒的反应，他也未参加此次研究。他说：“他们已经在细胞培养室做了试验，如果在动物身上做相关实验的话会引起科学界更大的关注。”
法国研究人员发现，哺乳动物细胞能关闭入侵的病毒。当病毒感染细胞后，它把自己的基因插入细胞的基因组，这样在细胞复制时也产生许多的病毒拷贝。研究人员已经知道植物和昆虫用RNA干扰使病毒基因沉默，在这个过程中，小的RNA分子将自己插入到基因表达机器中使某个基因沉默。动物也将RNA干扰用在一个调节功能上：它们在发育过程中通过RNA干扰改变自己基因的表达。Charles Henri Lecellier和同事现在发现，人类细胞也用RNA干扰来阻碍一个侵袭哺乳类的病毒的积累。
核糖核酸干扰技术
转录后基因沉默（PTGS， post- transcriptional gene silencing）-最初被认为仅限于矮牵牛花和其它一些植物中的奇异现象，是目前分子生物学研究中一个最热门的话题。过去几年中，科研工作者已明确转录后基因沉默现象普遍存在于动、植物中，在机体防御病毒入侵和转座子沉默效应中起着重要作用。但是最激动人心的是转录后基因沉默现象的技术应用，即在多种有机体中应用核糖核酸干扰（RNA interfere ,RNAi）技术进行特异性的基因剔除以研究相应的基因功能。那么核糖核酸干扰现象是如何被发现？它是怎样工作的？科研工作者怎样把它应用到功能基因组学的研究中呢？
10多年前，Rich Jorgensan和他的同事在矮牵牛花中发现一种奇怪的现象。他们尝试把由一强有力启动子控制的基因pigment-produing导入矮牵牛花以加深花的紫色，结果不但颜色未加深，许多花呈现杂色甚至白色。Rich Jorgensan把这种现象称为"共抑制"，因为外源性导入基因和内源性具有相似功能基因的表达都被抑制了。当时人们不知道这是一种转录后基因沉默。
双链核糖核酸能导致转录后基因沉默首先来自于对线虫的研究。1995年Guo和Kewphues试图用反义核糖核酸来阻断Par-1基因的表达以研究其功能。确实反义核糖核酸抑制了基因表达，出乎意料的是用作阴性对照的正义核糖核酸也抑制了基因表达。该结果一直让人迷惑不解，直至三年后Fire和Mello进行了另一实验才真正提出双链核糖核酸能导致转录后基因沉默的理论。Fire和Mello发现把反义核糖核酸和正义核糖核酸的混合物导入线虫后，其抑制效应远远强于单独导入反义核糖核酸或正义核糖核酸的抑制效应。再后来Baulcomb和Hamilton首先发现是~25nt的核糖核酸能特异性抑制具有相应互补序列的基因表达。
那么核糖核酸干扰（RNAi）是怎样工作的呢？首先外源导入的双链核糖核酸(dsRNA)被切割为21~23nt的小分子干扰核糖核酸(siRNA)。Dicer, 作为特异性核糖核酸酶家族的一个成员，切割双链核糖核酸为19~23nt小分子干扰核糖核酸（siRNA），这是一个依赖ATP的耗能过程. 切割后的 siRNA具有3'两个核苷酸TT突出末端。然后siRNA结合到核糖核酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体（RISC，RNA-induced silencing complex）。该复合体依赖ATP释能而解聚siRNA双链成单链以激活RISC。活化的RISC通过由siRNA决定的碱基互补配对原理切割具有同源序列的基因转录体，最终导致基因沉默效应。目前具体的切割机制还不明了，研究表明每个RISC包括单链siRNA和核糖核酸酶RNase。.
由于RNAi强大的基因沉默效应，有人提出了RNAi通路的效应扩增问题。RNAi通路的效应扩增可能是通过细胞复制外源导入的dsRNA或siRNA本身而实现的。另外，RISC的多次反复使用也能扩增RNAi的基因沉默效应。
科研工作者已开始RNAi效应增强子和效应抑制子的研究，认为RNAi是机体细胞一种强有力的基因调控机制。但是在哺乳细胞中外源导入大分子dsRNA（>30nt）常常导致非特异性的基因沉默效应，因为它激活了核糖核酸酶RNaseL而导致非特异性的RNA降解。相反，siRNA（<30nt）不激活RNaseL，而是通过序列特异性的方式诱导基因沉默效应。该序列特异性方式非常严格，一个碱基的错配会显著降低基因沉默效应。所以siRNA可以解释如下，它是一种具有3'两个核苷酸TT突出末端的21~23nt大小的双链核糖核酸，作为RNAi的中介分子，通过序列互补配对法则特异性降解目的基因。
siRNA可以经化学合成，比如著名生物学公司Proligo、Orbigen在siRNA合成方面处于世界领先水平，它们既提供即用型siRNA，也提供标记生物素、荧光素和磷酸等的siRNA更方便监测其抑制特异基因表达的效果
siRNA也可以通过体外转录获取。它相对便宜，尤其适合于同时合成多个siRNA。虽然理论上说，任何一个具有3'两个核苷酸TT突出末端的19~23nt小分子干扰核糖核酸 siRNA都具备序列特异性的基因沉默效应，但是由于位置效应，比如某些序列，尤其是调控序列易被蛋白质附着而阻止RISC的抑制效应，所以科研工作者首先合成2~4个siRNA进行预实验以选定作用最佳者。RNA专家Ambion公司提供通过体外转录获取siRNA的商品化试剂盒，使这一选择过程简单方便。
目前外源注射和转染是转运siRNA到细胞或机体的主要途经，之后基因沉默效应可以持续数天，同时传至下一代细胞，但终将短时间内消失，因此，最近许多科研小组开发了siRNA的表达质粒，通过瞬时转染或稳定转染以达到在细胞内不断表达siRNA的目的。有些质粒是表达小发夹结构RNAs（shRNAs, small hairpin RNAs）, 在细胞内它被加工处理为siRNA样分子，诱导基因沉默。该质粒是在polyMeraseⅢ启动子和4~5个碱基T转录终止信号中插入shRAN。由于polyMeraseⅢ的特性，转录常常在第二个T终止，插入序列折叠成step-loop结构并带有3'-UU突出末端。该质粒设计是基于线虫、果蝇等中的实验结果，因为其中的基因沉默效应就是通过step-loop而诱导。另外一种siRNA表达质粒是把编码正义和反义的siRNA分别受控于各自的polyMeraseⅢ启动子。两种质粒的基因沉默效应相当。Invivogen公司和Imgenex公司都有操作简单、作用有效的商品化试剂盒提供。而Gene Therapy System 公司的siRNA构建试剂盒则完全采用了不同的机制。该试剂盒首先PCR合成目标序列，然后由T7RNA多聚酶进行体外转录，经退火和纯化处理的体外转录dsRNA模板被重组的Dicer酶切割，从而快速、高效地产生大量小分子干扰RNA（siRNAs）。产生的siRNAs混合物，比单一形式的siRNA更可能导致基因表达沉默。
基于目前的发表文献和一些实验经验，siRNA的设计可遵循以下几点进行1）选择以碱基A或G开始的19~21nt大小的目的mRNA。因为RNA polyMeraseⅢ启动子只有在第一个转录碱基是嘌呤时才能有效作用。2）针对目的mRNA一般选择2~4个不同序列，GC含量为30~50%，避免四个碱基T或A的连续序列，避免选择起始密码下游50~100nt、终止密码上游100nt以及5'和3'的非编码区域，BLAST检查设计序列的特异性。3）设计适当的实验对照，比如设计有1~2个碱基错配的序列，或者是随机变更siRNA的碱基排列顺序。
RNAi的研究刮起了科学界的风暴，siRNA迅速有效抑制特异基因功能的性质促使科研工作者不断深入完善该领域的研究。RNAi可能是未来发展基因治疗策略的新希望所在。RNAi技术必将带来功能基因组学的革命。
10 May 2005
Human RNA silences viral DNA
RNA silencing can defend against viruses in humans, French scientists report in this week's Science. Surprisingly, say the scientists, microRNA (miRNA) appears to form the basis of this system. "MiRNAs were thought to be involved in the regulation of endogenous genes, whereas exogenous RNAs, in particular viral RNAs, were thought to be regulated by siRNA [small interfering RNA]," lead author Charles-Henri Lecellier at the Institute of Plant Molecular Biology in Strasbourg, France, told The Scientist.
Prior studies have revealed that RNA interference can destroy viruses in plants and insects, but a similar role in vertebrates has not been demonstrated. Since RNA silencing can suppress endogenous retroviruses from mobilizing in plants, yeast, worms, and flies, Lecellier and colleagues reasoned that retrotransposition of mammalian exogenous viruses might also prove vulnerable. They chose as their model system the primate foamy virus type 1, a retrovirus akin to HIV.
PFV-1 accumulation in cultured human embryonic kidney cells was strongly enhanced by the expression of the P19 silencing suppressor, suggesting that a siRNA or miRNA pathway limited PFV-1 replication in human cells, because P19 specifically binds to and inactivates both. To identify the target and means of human RNA silencing, the investigators fused viral sequences spanning the PFV-1 genome to a green fluorescent protein (GFP)–tagged reporter gene into constructs cotransfected with PFV-1 into baby hamster kidney cells. Northern and Western analysis revealed GFP levels from construct F11 were disproportionately reduced compared to F11 mRNA accumulation, which reminded researchers of miRNA translational inhibition. The DIANA-microT algorithm revealed a high probability match between the F11 sequence and the human miR-32.
Further studies demonstrated miR-32 silencing was suppressed in P19-expressing cells. Also, anti-miR-32 locked nucleic acid oligonucleotide almost doubled progeny virus production, unlike anti-miR-23, suggesting miR-32 has a direct, sequence-specific antiviral effect. In plants and insects, all viruses targeted by RNA interference encode proteins that suppress RNA silencing. Further studies found that in PFV-1, Tas, a viral transactivator, was that protein.
In Arabidopsis, transgenic Tas expression strongly decreased siRNAs and led to developmental anomalies reminiscent of those elicited by suppressors interfering with miRNA functions, such as leaf elongation and serration, suggesting Tas suppresses a fundamental step conserved from plants to mammals shared between the miRNA and siRNA pathways. Like Tas, another protein, AC2, encoded by the DNA plant viruses, geminiviruses, is a viral transactivator that can suppress RNA silencing. "We want to investigate whether transactivation and suppression are linked or completely separate," Lecellier said.
Researchers currently think each cell type harbors its own specific miRNA repertoire, Lecellier said. "This idea could partially explain some of the differences in viral permissivity observed between specific tissues," he said, with viruses preferentially replicating in cell types where antiviral miRNAs are not expressed or are only weakly expressed.
A miRNA response could also lead to the emergence of viral quasispecies, as viruses that can rapidly introduce synonymous mutations into their genomes, such as HIV or influenza, do so to evade silencing by miRNA. "The emergence of quasispecies is important for resistance to antiviral strategies, so studying this miRNA response could be important for studying resistance," Lecellier said.
The team saw no evidence that human cells used siRNAs to disable viruses. "So it'd be interesting to investigate whether or not mammals have lost the ability to respond to viruses using siRNAs because they have a more advanced immune system than plants and flies and worms," said Phillip Zamore at the University of Massachusetts, who did not participate in this study. It was uncertain whether the miRNAs were part of a dedicated antiviral response or whether they accidentally silenced viral RNA, he said. "It'd be interesting to see whether expression of miRNAs are vastly upregulated in viral infection," he told The Scientist.
Future directions should involve testing any of the several hundred human microRNAs against viruses such as HIV and influenza, said Shou-Wei Ding at the University of California at Riverside, who did not participate in this study. "Also, they studied this in cell culture, and it'd be interesting to look at this at the whole animal level," Ding told The Scientist.
The Scientist
May 10, 2005
Original web page at BioMed Central
