连续床的制备
连续床的制备简单、快捷。
1 装柱 将一定量合适的功能单体、配基和交联剂 或催化剂 溶入溶剂中 , 混合均匀 , 立即加入到已洗净的层析柱中。
2 聚合 让上述单体溶液在层析柱中聚合 ,这是靠疏水作用、氢键或共价作用进行的。
3 压缩或冲洗 聚合一段时间后 , 在床层的上端连接一台HPLC蠕动泵 ,靠泵的流动相对床层进行压缩、冲洗 ,流速应等于或略高于分离时要采用的流速 ,同时 ,还可借助柱上端的活塞进行压缩。经上述方法制得的色谱柱称为连续床。床层在聚合过程中形成致密的网链交错结构 , 网链之间形成许多“渠道” , 如图 2 。渠道实质上与传统色谱柱中颗粒空穴起着同样的作用。渠道足够大 , 其能允许生物大分子通过 , 但网链自身是无孔结构 , 生物大分子不能进出 , 从而减少了扩散路径 , 提高了分辨率。
离子交换连续床色谱
1991年 , S. Hjerten 等 制备了阴离子交换连
续床色谱。方法如下: 取 N , N′- 亚甲基双丙烯酰胺 Bis 0.24 g , 加入到 9.5 mL、0.01 mol/L 磷酸钠缓冲液 pH 值 6. 4 中 , 然后加入 0. 12 mL 烯丙基二甲基胺、0. 3 g 硫酸铵 , 搅拌溶解后 , 加入200μL 质量分数为10 %的过硫酸铵、200 μL 5 %四甲基乙二胺 , 混匀后 , 将溶液快速移入事先准备好的柱子中 , 密封 , 让其交联聚合 5 h; 然后泵入0.01 mol/L 的 tris- HCl 缓冲液 pH值 8.5 , 流速为0.5 mL/ min , 对床层进行压缩。制得的连续床已成功地用于血红蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白、藻红蛋白的分离。阳离子交换连续床色谱的制备方法基本同上 ,主要区别在于将烯丙基二甲基胺用 50μL 丙烯酸替代。
疏水作用连续床色谱
疏水作用连续床色谱的制备方法与离子交换连续床色谱类似 , 它是将一定量的Bis、硫酸铵溶于去离子水中 , 然后加入适量丙烯酸丁酯、过硫酸铵、四甲基乙二胺 , 交联聚合 , 压缩后制得。Chengming Zeng 成功地用该连续床色谱柱分离了细胞色素、肌血球素、核糖核酸酶、溶解酵素胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和铁蛋白。
反相连续床色谱
Frantisek Svec 小组制备的连续床可稳定使用 5 周以上 。因此 , 连续床的耐用性很好 , 并且如此宽pH值的使用范围 , 使得连续床能用于多种物质的分离纯化 , 在 pH = 3～11 内 , 连续床对缓冲液的容量很高 , 而这正是离子交换色谱所需要的 。目前 , 连续床制备中最大的问题是聚合条件的实验 , 如温度、pH值、时间以及各组成的浓度等 。
问题与展望
连续床与传统柱色谱相比 , 最大的优势在于它的孔道壁不允许蛋白质和多肽通过 , 因此它的分辨率不随流速变化而变化 , 甚至随流速增加 , 分辨率增大 , 这样避免了传统层析柱中分辨率与流速二者不可兼顾的难题 。反相色谱实验表明 , 随着温度的增加 , 分辨率增加 , 但当到达一定温度时 , 由于被分离蛋白变性 , 分辨率反而下降 。Hjerten小组制得的连续床可在 pH = 1～11 范围内稳定使用 3 周以上 , 在 pH 值为 12 时使用 6 h ;
Frantisek Svec 小组制备的连续床可稳定使用 5 周以上 。因此 , 连续床的耐用性很好 , 并且如此宽pH值的使用范围 , 使得连续床能用于多种物质的分离纯化 , 在 pH = 3～11 内 , 连续床对缓冲液的容量很高 , 而这正是离子交换色谱所需要的 。
目前 , 连续床制备中最大的问题是聚合条件的实验 , 如温度、pH值、时间以及各组成的浓度等 ,希望能找到最佳条件 , 以致在压缩后 , 渠道直径不能太小而让流动相不能通过。另一问题是连续床渠道壁不能太软而易变形或太硬而易脆 , 故需寻找更好的单体。
