加热可以引起生命物质如蛋白质、核酸和脂类的破坏，从而导致其死亡。目前使用的有两大类，即干热灭菌和湿热灭菌。干热灭菌最常见的例子是用火焰灭菌。这是最彻底的灭菌方法，但是并不是随时随处可以应用的。我们常常用这种方法来处理病死的家畜家禽。实验室或发酵车间也经常用火焰灭菌。在要求灭菌后的器具干燥的情况下，通常也采用干热灭菌。例如用电烤箱在160℃左右保持2小时，可以将玻璃或金属器皿完全灭菌。
湿热灭菌的方法更多。因为在有水或水蒸汽存在的条件下，细胞内部更易遭受伤害，所以可以在较低的温度和较短的时间内达到灭菌的目的。微生物的营养细胞比较容易被杀死，而芽孢则较耐热。下表列出了在湿热条件下杀灭几类主要微生物所需要的温度和时间。
杀灭几类主要微生物的湿热条件
微生物
营养细胞
孢子或芽孢
酵母菌
50-60℃，5分钟
70-80℃，5分钟
霉菌
62℃，30分钟
80℃，30分钟
细菌（中温细菌）
50-70℃，10分钟
2-800分钟，100℃；或120℃，05-12分
病毒
60℃，30分钟
目前采用的湿热灭菌方法有：
1）常压法。其中主要有巴斯德消毒法、煮沸消毒法和间歇灭菌法。前两种条件比较温和，所以不能消灭全部微生物，因此是消毒。
巴斯德消毒法最早是法国伟大的微生物学家巴斯德用来处理葡萄酒防止其变酸的办法，所以一直用巴斯德的名字命名。这种方法目前仍然大量使用在食品行业，用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等的消毒。消毒后可以保持食品的原有风味。这种方法具体实施时对温度和作用时间的控制要看处理对象决定。例如目前对牛奶的消毒就有低温维持法和高温瞬时法两种，前者是在63℃维持30分钟，后者则是在72℃处理15秒。
煮沸消毒法是在常压下通过煮沸来达到消毒目的。例如在非高原地区将水加热到100℃来消毒饮用水。
间歇灭菌法又叫分段灭菌法。在没有高压灭菌设备，灭菌对象又比较稳定的情况下，可以达到基本完全灭菌的目的。一般用于液体的灭菌。方法是将要灭菌的液体在90-100℃加热15分钟以上，使营养细胞死亡，然后将其冷却到30℃，并保持这个温度过夜，这时，灭菌样品中没有被杀死的芽孢因为温度适合而萌发成营养细胞，到第二天再把该液体在90-100℃加热15分钟以上。如此重复3次，即可以将液体中的微生物全部杀死，达到灭菌的目的。某些做微生物学实验的培养基，因为某些成分在120℃左右容易破坏，就可以采用间歇灭菌法。
2）加压法。又称加压蒸汽灭菌法，因为在超过大气压的密闭容器中，水蒸汽的温度可以大于100℃，更有利于杀死微生物。例如用加压灭菌锅（亦可用家用压力锅），当锅内压力达到每平方厘米1千克时，水蒸汽的温度可以达到121℃，一般微生物的营养细胞和芽孢在这个温度下通常在15-30分钟内即可彻底被杀死。加压蒸汽灭菌法是微生物学研究和微生物应用产业中采用得最多的灭菌方法，从19世纪沿用至今。随着灭菌器具的不断改进，效率也越来越高。
