蛋白质组学中的蛋白质纯化手册(生物实验室系列)(Purifying Proteins for Proteomics)
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品牌: 理查德J.辛普森
基本信息·出版社：化学工业出版社
·页码：734 页
·出版日期：2009年
·ISBN：7122018334/9787122018335
·条形码：9787122018335
·包装版本：1版
·装帧：平装
·开本：16
·正文语种：中文
·丛书名：生物实验室系列
·外文书名：Purifying Proteins for Proteomics
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内容简介蛋白质组学这一领域刚开始趋于成熟，而开展蛋白质组学研究首先要把蛋白质从复杂的大分子混合物中分离纯化出来。为此，需要经过验证并值得信赖的蛋白质分离纯化方案以用于蛋白质组学研究。
原著“Purifying Protein s for Proteomics：A Laboratory Manual”由国际权威专家Richa rd J．Simpson联合全球知名的专业实验室共同撰写，著名的美国冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory P ress)推出，是《蛋白质与蛋白质组学实验指南》的姐妹篇。
以蛋白质组学中的蛋白质纯化为核心。《蛋白质组学中的蛋白质纯化手册》的主要内容有：
★蛋白质纯化和蛋白质组学的各种实用技术。包括专门用于蛋白质组学研究的制备技术、色谱方法和电泳技术，用于结构蛋白质组学研究的蛋白质纯化分析技术等
★上述各种技术方法的背景资料、理论、实验方案、疑难解答以及相关的支持性信息和参考资料
《蛋白质组学中的蛋白质纯化手册》尽可能完全地罗列了各种实验方案，可供不同规模实验室的研究者选择应用。在介绍每一个实验方案时，以“step-by-step”操作指南的形式逐步展开，详细列出实验仪器、试剂及操作步骤，并针对常见问题给出经验性的提示或解决方案。
毫无疑问，对于蛋白质化学、生物化学的研究人员在蛋白质组学这一新兴领域寻求最新的技术方法，《蛋白质组学中的蛋白质纯化手册》是一部必备的实验指南。而对于遗传学、细胞生物学、分子生物学研究人员开展表型和细胞功能研究，以及医学和生物工程领域开展蛋白质相关研究，《蛋白质组学中的蛋白质纯化手册》也是基本的实验工具书。
目录
第1部分：供蛋白质组学分析的蛋白样品制备
第1章 分离科学在蛋白质组学中的作用
1.1 制备纯化蛋白：蛋白质微阵和结构蛋白质组学的瓶颈
1.2 以质谱为基础的蛋白质鉴定
1.3 蛋白质组学所面临的一个关键技术的挑战：减少样品的复杂性
1.4 本书的概述
参考文献
选读文献
网络资源
第2章 蛋白质的纯化策略
2.1 挑战
2.2 蛋白质的量和纯度要求
2.3 重组蛋白通常能简化纯化过程
2.4 可根据蛋白质的内在特性来分离蛋白质
2.5 设计蛋白质纯化方案
2.6 应用：膜相关抗原A33的纯化
参考文献
选读文献
第Ⅱ部分：蛋白质组学中制备蛋白样品的色谱方法
第3章 蛋白质和肽纯化的色谱方法导论
3.1 基本概念
3.2 色谱·眭能
实验方案
方案1轻拍一填装法干式填装刚性固体柱
色谱术语表
参考文献
选读文献
网络资源
第4章 全蛋白的多维色谱
4.1 MDLC用于蛋白质分级分离的目的
4.2 策略
4.3 主要文献概述
4.4 MDLc的理论参数
4.5 色谱模式：正交性与相容性
4.6 与其他技术的性能比较
4.7 MDLC的常见问题
4.8 发展潜力
4.9 样品处理方案：SEC／反相色谱法分离大肠杆菌蛋白
4.1 0研究实例：MDLC分析酵母蛋白提取物
4.1 1结论
参考文献
第5章 可溶性重组蛋白的高通量筛选
5.1 引言
实验方案
方案1设计平行克隆表达载体
方案2平行克隆所用载体的制备
方案3黏末端PcR产物的制备和消化载体的连接
方案4把DNA转化到细菌中
方案5诱导和筛选可溶性融合蛋白
参考文献
第6章 离子交换色谱
6.1 IEC利用了分子间的静电力
6.2 几种IEC的模式
6.3 ：IEC中缓冲液的选择很重要
6.4 离子交换介质和色谱分离装置
实验方案
方案1离子交换柱的选择
方案2离子交换柱的制备
方案3用IEC分离蛋白质
IEC柱的清洗
IEC的优化和常见问题
参考文献
网络资源
离子交换介质的供应商
第7章 尺寸排阻色谱
7.1 小分子更易进入凝胶介质间的空隙
7.2 分配系数Kd和有效分配系数K描述了溶质在特定凝胶中的洗脱情况
7.3 SEC分离相似形状分子的能力取决于凝胶的选择范围
7.4 分子的形状对其洗脱时间的影响
7.5 影响洗脱蛋白分辨率的因素
7.6 SEC在纯化方案中的作用
7.7 SEC中缓冲液、溶液和试剂的配制
7.uSEC中蛋白样品和肽样品的预处理
7.9 SEC液相色谱装置
7.10 利用SEC分离纯化的例子
实验方案
方案1尺寸排阻色谱柱的填装
方案2尺寸排阻色谱的制备
附加方案：分析性尺寸排阻色谱
方案3用尺寸排阻色谱进行蛋白质的脱盐和缓冲液的更换
柱的清洗和保养操作
关于SEC的常见问题
参考文献
第8章 反相高效液相色谱在蛋白质分离和纯化中的应用
8.1 ：RP-HPLC的特点与机制
8.2 分离机制
8.3 RP-HPLC基于“疏水脚”的细微差异分离多肽
8.4 RP-HPLC柱的特点与操作
8.5 流动相
8.6 温度
8.7 表面活性剂对反相分离的影响
8.8 在质谱鉴定前用RP-HPLC分级分离多肽
8.9 RP.HPLC常见问题指南
实验方案
方案1RPHPLC分离蛋白质的标准色谱条件
方案2RP-HPLC分离多肽的标准色谱条件
参考文献
选读文献
网络资源
第9章 疏水相互作用色谱
9.1 HIC与RP-HPLC的区别
9.2 HIC的基本原理
9.3 实验的影响因素
实验方案
方案1用HIC分离蛋白质
参考文献
第10章 亲和色谱与免疫亲和色谱
10.1 亲和色谱的实际应用
10.2 凝集素亲和色谱
10.3 配基亲和色谱
10.4 免疫亲和色谱
10.5 DNA亲和色谱
10.6 共价色谱
10.7 采用巯基一二硫键互换反应的共价色谱
实验方案
方案1凝集素一琼脂糖凝胶亲和色谱
方案2蛋白质配基亲和色谱
方案3制备抗体亲和树脂过程中抗体的定位
方案4DNA亲和柱的制备
方案5DNA亲和色谱
方案6从仅被混有不可逆失活的亚磺酸氧化产物中以可逆失活混合的二硫化物形式纯化木瓜蛋白酶
方案7以琼脂糖一谷胱甘肽一2一吡啶二硫化物凝胶作为填料的共价色谱
方案8使用活化的Thiopropyl一Sepharose6B凝胶的共价色谱
参考文献
网络资源
第11章 蛋白质组学研究中的染料配基亲和色谱
11.1 方法的设计和优化
11.2 染料配基吸附剂的再生和储存
实验方案
方案1染料在多羟基介质中的固定化
附加方案：固定化配基浓度的测定
方案2通过结合目的蛋白的能力来筛选固定化染料
方案3吸附条件的优化
方案4洗脱条件的优化
方案5分批式试管法计算吸附剂的有效容量
方案6用染料配基亲和色谱纯化蛋白
11.3 研究实例：使用CibacronBlue3GA-Sepharose亲和吸附剂纯化重组甲酸脱氢酶
参考文献
第12章 固定化金属离子亲和色谱
12.1 IMAC的基本原理
12.2 IMAC的基本操作
12.3 IMAC最常用于纯化带多聚组氨酸标签的蛋白质
12.4 目的蛋白性质未知时可使用IMA
12.5 磷蛋白和磷酸肽的分离
实验方案
方案1IMAC预装柱的准备
第13章 用羟磷灰石进行蛋白质色谱
第14章 色谱聚焦
第Ⅲ部分：蛋白质组学中制备蛋白样品的电泳方法
第15章 电泳分离蛋白质策略导论
第16章 双向凝胶电泳分离蛋白质
第17章 在MCE中通过等电位分段法进行高分辨率双向凝胶电泳来制备样品
第18章 一种电泳纯化蛋白质的方法：GradiflowBF400仪
第19章 用自由流动电泳技术纯化蛋白质
第Ⅳ部分：用于结构蛋白质组学的纯化蛋白的分析
第20章 已纯化蛋白质鉴定方法导论
第21章 用质谱测定蛋白质的特性
第22章 分析超速离心：蛋白质大小、构象和相互作用
第23章 蛋白质构象稳定性的测定
第24章 表面等离子体共振与质谱联用：鉴定结合配体及描述相互作用
第25章 糖蛋白中糖的分析
附录1 蛋白质结构概述
附录2 蛋白质浓度的测定
附录3 蛋白质溶液的浓缩
附录4 蛋白质的储存稳定性
附录5 单向聚丙烯酰胺凝胶电泳
附录6 疑难问题解决指南
附录7 注意事项
索引
……[看更多目录]
序言随着各种基因组序列计划的成功完成，包括人类基因组在内的150多个已公开的基因组计划，生物学家现在关注更多的是各个基因组中编码蛋白的结构和功能，试图确定基因的真正功能。由于此领域的兴趣不断增长，冷泉港实验室出版社（ColdSpring Harbor Laboratory Press）于2003年出版了《蛋白质与蛋白质组学实验指南》（Proteins and Proteomics：A Laboratory Manual）一书，全面介绍了各种蛋白质组学研究方法，包括蛋白质分离，特别是单向凝胶和双向凝胶（2D胶）的方法，以及经典的“pull-down”技术，即用亲和标签来分离蛋白质及其相互作用配体。此书还包括如何用传统的氨基末端和羧基末端序列分析以及质谱方法，来鉴定通过这些手段分离出来的蛋白质（包括翻译后修饰，特别是磷酸化位点）。
现在，蛋白质组学这一领域刚开始趋于成熟，很明显，除了传统的单向凝胶和双向凝胶方法外，蛋白质组研究中还需要其他分离工具，特别是要想了解那些珍贵而又稀少的蛋白质时。对一些与疾病有关的低丰度生物标记物和某些难以用2D胶处理的蛋白质（如膜蛋白）更是如此。例如，大多数用2D胶获得的蛋白质表达谱实验中，只有在细胞或组织中分布量大的蛋白质（如管家蛋白和结构蛋白）才可以观察到。一个细胞内蛋白质的分布动态范围是105～106数量级。例如，肌动蛋白（细胞中分布最为广泛的蛋白质）在每个细胞内的浓度为10。个分子，而某些细胞受体或转录因子在每个细胞内只有102～10。个分子。当研究像血液这样的生物样本时，这个问题就更明显了，血清白蛋白以40mg／ml的量存在，细胞因子则以低达pg／ml的量存在，蛋白质分布的动态范围约为109。因为2D胶上能检测到的蛋白质的动态范围约为104，如果结合某些预分级分离技术是可以去除高丰度蛋白的，使感兴趣的低丰度蛋白能分离出来。
《蛋白质组学中的蛋白质纯化手册》作为《蛋白质与蛋白质组学实验指南》的姊妹篇，其目的是为研究者提供重要的纯化策略（第1部分）、预分级分离的方法一一色谱（第Ⅱ部分）和电泳（第Ⅲ部分），以避开动态范围的限制。除了这些预分级分离方法外，本书还涵盖了许多经典的蛋白质分离方法。这些方法可用来进行高分辨率三维结构分析，即以结构基因组学（也被称为结构蛋白质组学）和蛋白质微阵（蛋白质芯片）分析为目的的高通量制备纯化蛋白质。此外，第1V部分介绍了测定纯化蛋白-功能完整性的方法（如构象稳定性、精确分子质量，聚合状态的测定以及用表面等离子体共振测定结合特性），还描述了糖蛋白中糖的分析；提供的实验方案详述了如何从糖蛋白中除去聚糖和制备单糖用于GC-MS鉴定。
文摘插图：
如果一个蛋白质的结构不能从其氨基酸序列来得以精确的预测，那么，我们如何能在一定水平上搜索到有关其功能方面的详细知识呢？在不久的将来，至少能通过下面的方式得到答案，即将目的蛋白纯化到足够程度并获得足够量，以允许对其生物化学和结构进行精细的分析。如果研究者有一个好的纯化方案可以遵循，那是非常幸运的。事实上，更多的时候不是这样的，而是要修改已有的纯化方案，甚至要重新做一个方案。本章概述了在设计纯化方案时需要考虑的因素以及在蛋白质纯化中某些新的和令人振奋的发展。各种蛋白质分离形式的理论和应用细节将在后面的章节中叙述。
如果考虑到生物基质（如细胞或组织提取物）中存在复杂的大分子混合物时，那么蛋白质纯化面临的挑战就不言而喻了。由双向凝胶电泳获得的人上皮细胞蛋白质谱（表达谱）就证明了这种复杂性（图2.1）。在特定的细胞中，除感兴趣的蛋白质（目的蛋白）外，还存在几千种具有不同性质的其他蛋白质（保守估计为5000～8000种），连同一起的还有非蛋白质物质，如DNA、RNA、多糖和脂类。即使是蛋白质，它们在细胞中的量也不同。某种高丰度的细胞骨架蛋白（如肌动蛋白）在细胞提取物中可能占到蛋白质总量的10％。另一种极端的例子是某种稀少的转录因子可能以非常低的水平（
